رشته حقوق

مقاله رایگان درباره TA، AT، AG، ریخته

دانلود پایان نامه

هود).
فنل ( Phenol ) ترکیبی است که از جایگزینی هیدروژن یک هسته آروماتیک با گروه هیدروکسیل ( OH ) ایجاد می‌شود. از این لحاظ از نظر ساختمان شیمیایی ، فنل یک الکل نوع سوم مخصوص می‌باشد وبسیار سمی است .

شکل 3-10- محلول فنل بر روی یخ قرار داده می شود تا در زیر هود به نمونه ها افزوده شود
15- سانتریفیوژ درrpm13000 به مدت 12 دقیقه .
16- مایع رویی را برداشته وبه حجم مساوی کلروفرم-ایزوآمیل اضافه کرده ومخلوط کنید سپس 20 دقیقه روی یخ بماند.
این کار با دقت طوری انجام می شود که با زواید سلولی موجود در فاز پایینی مخلوط نشود.
17- سانتریفیوژدرrpm13000 به مدت 10 دقیقه و سوپر ناتانت(مایع رویی) برداشته شود.
پس از عمل سانتریفوژدو فاز کاملا مشخص در هر میکروتیوب بوجود آمد سوپرناتانت یا مایع رویی که حاوی DNA بوده به آرامی وبا احتیاط جدا شده وسپس به میکروتیوب های استریل دیگر منتقل شد.فاز پایینی دور ریخته شد.
18- افزودن 10/1 حجم سدیم استات و2 حجم اتانول100% ونگهداری به مدت 1 ساعت روی یخ.
به میزان یک دهم حجم مایع رویی برداشت شده،سدیم استات وبه میزان دو برابر حجم محتویات هر میکرو تیوب،اتانول خالص سرد اضافه شده وبه مدت یک ساعت روی یخ قرار می دهیم.
19- سانتریفیوژدر rpm 14000 به مدت 10 دقیقه ومایع رویی دور ریخته شود.

شکل 3-11 – مشاهده DNA تشکیل شده در انتهای تیوپ
20- Pellet با الکل 70%(150 میکرو لیتر) شسته وسانتریفیوژ باسرعت rpm14000 به مدت3 دقیقه واتانول دور ریخته و خشک شود و در TE(10:1) به مقدار 200 میکرو لیتر حل شود.
21- NaCl (M 5/2) برابر حجم افزوده شود(یعنی 200 میکرولیتر) وخوب بهم بزنید و سپس 2 حجم الکل اتانول خالص (یعنی 400 میکرو لیتر) اضافه کرده وبمدت30 دقیقه روی یخ بماند وسپس سانتریفیوژدر rpm 14000 به مدت 10 دقیقه .
22- مایع رویی دور ریخته شود ومجددا شستشو با اتانول 70% وسانتریفیوژ درrpm 14000 به مدت 3 دقیقه .
23- Pellet خشک شود (وکیوم 10 دقیقه) ودر TE(1/0 :10) به مقدار 200 میکرو لیتر حل شود ونگهداری در دمای 80 – درجه سانتی گراد .
پس از شستشو با اتانول،مایع رویی دور ریخته شده وتیوب ها به صورت وارونه روی یک کاغذ صافی قرار داده سپس میکروتیوب های حاوی pellet را به دستگاه وکیوم منتقل کرده تا رسوبDNA کاملا خشک شود.به رسوب خشک شده 200 میکرولیتر بافرTE استریل اضافه شد .DNA استخراج شده تا زمان استفاده در یخچال ودر دمای20- درجه سانتی گراد نگه داری گردید.

شکل 3-12- پلیت حاوی DNA را در وکیوم گذاشته تا خشک شود.
3-4- تعیین کمیت وکیفیت DNA ژنومی
موفقیت اکثر آزمایش های زیست شناسی مولکولی در وهله اول وابسته به کیفیتDNA استخراج شده و دقت در برآورد غلظت می باشد. لذا پس از استخراج وقبل از انجام هرگونه آزمایشی باید حضورDNA اثبات گردد ومقدار وکیفیت آن تعیین گردد. بدین منظور از الکتروفورز افقی با ژل آگارز وبرای تعیین کمیتDNA از دستگاه اسپکتروفوتومتر استفاده شد.
3-4-1- اندازه گیری غلظت DNA به روش اسپکتروفتومتری
یکی دیگر از روش های معمول برای تعیین غلظت و کمیتDNA ،محاسبه میزان جذب نوری در دستگاه اسپکتروفوتومتر می باشد. در این روش براساس مقدارجذب نوری نمونه ،در طول موج های خاصی می توان مقدار DNA ودر صد خلوص آن نمونه را تعیین کرد.
امروزه این روش به طور معمول برای تعیین خلوص ومقدارDNA در نمونه ها به کار می رود. اسید های نوکلئیک با ترکیبی از چهار نوکلئوتید،عمدتا نور فرا بنفش با طول موج 260 نانومتر را جذب می کنند. پروتئین ها که متداول ترین آلوده کننده های اضافی در نمونه هایDNA می باشند نور فرابنفش را در دو طول موج 260 و280 نانومتر جذب می کنند . زنجیره های پلی پپتیدی که معمولا دارای سه اسید آمینه حلقوی می باشند، طول موج 280 نانو متر را بهتر جذب می کنند. اما برخی دیگر از پرو تئین ها مانند هیستون ها یاپروتامین ها که فاقد یا دارای تعداد اندکی از اسید های آمینه حلقوی می باشند در طول موج280 نانومتر فاقد یا دارای حداقل جذب نوری می باشند. از طول موج 230 نانومتر نیز برای تعیین آلوده کننده های فنلی والکلی ونمک ها استفاده می شودطول موج 320 برای تعیین پلی ساکارید ها وسایر ترکیبات باقی مانده استفاده می شود.لذا با محاسبه جذب نو ری نمونه های DNA در طول موج های 230 ،260،280و320 ومحاسبه ی نسبت های جذب260به280 می توان خلوص DNA 31را مشخص نمود . میزان خلوص DNA استخراج شده از رابطه زیر بدست می آید:
P=?260 / ?280 = DNA میزان خلوص
به طور آیده ال نسبت 260 به280 که برآوردی نسبت DNA به پروتئین ها است باید بین 8/1 تا 2 باشد . در صورتی که این نسبت کمتر از این مقدار باشد کیفیت DNA کمتر از حدی خواهد بود که بتوان از آن در آزمایش های مولکولی استفاده کرد.
برای تعیین غلظت DNA 32در یک نمونه بر حسب نانوگرم بر میکرو لیتر از رابطه زیر استفاده می شود:
q=(?260- ?320)×100×50
در این دستگاه از طول موج های 260 ، 280 ، 230 و320 نانومتر استفاده می شود. ظرفیت کوت ها (سل ها)1000 میکرولیتر بود قبل از عمل اندازه گیری غلظت DNA ،باید دستگاه کالیبره شود. برای این کار ابتدا کوت ها را با آب دو بار تقطیر شستشو داده ، سپس 990 میکرو لیتر آب دو بار تقطیرداخل آن می ریزیم یکی از کوت ها در دستگاه قرار گرفت. با فشردن کلید کالیبره کردن مقادیر 260 و280 روی صفر تنظیم شد.سپس 10 میکرولیتر از استوکی که قبلا تهیه شده بود وحاوی نمونه هایDNA بود در کوت دستگاه ریخته شد پس از اضافه کردن DNA ،کوت در دستگاه قرار داده شد ومقدار اعداد در طو
ل موج های به ترتیب 320،280،260،230 ثبت گردید که به ترتیب بیانگر نمک ها ،اسید های نوکلئیک ، پروتئین ها و هیدارت های کربن وسایر ترکیبات می باشد.

مطلب مشابه :  پلورالیسم دینی

شکل 3- 13- تعیین کیفیت DNA توسط دستگاه اسپکتروفتومتری با طول موجهای 230-260-280,320
3-4-2 – اندازه گیری کیفیت DNA با استفاده از ژل آگارز
یکی از روش های ساده گزینش DNA با کیفیت عالی وفاقد شکستگی وتعیین حضور یا عدم حضور آن،استفاده از الکتروفورز افقی به وسیله ژل آگارز 8/0 % می باشد. در این غلظت آگارز،قطر منفذ های ژل بزرگ می باشند و برای بارگذاری DNA استخراجی که به صورت توده ای و به هم فشرده است، مناسب بوده وامکان حرکت DNA روی ژل را فراهم می آورد. جهت استفاده از ژل با ظرفیت 25 میلی لیتر ونیز تهیه آگارز 8/0 در صد،2/0 گرم آگارز را درون یک ارلن ریخته و به وسیله بافر TAE به حجم 25 میلی لیتر می رسانیم. محلول تهیه شده را درون مایکروفر قرار داده تا آگارز حل وذوب شود. سپس اجازه می دهیم این محلول در دمای محیط سرد شود،به گونه ای که دست را نسوزاند (حدود 60 درجه سانتی گراد).به منظور مشاهده باند ها ونشاندار کردن DNA بدون تغییر آن به میزان 5/1 میکرو لیتر اتیدیوم بروماید(مایع قرمز رنگ،بسیار سمی وسرطانزا)به آن می افزاییم ،شانه را در مخزن ژل قرار داده وسپس ژل را درون مخزن می ریزیم.مخزن ژل باید روی یک سطح تراز قرار گیرد تا ضخامت آن در همه قسمت ها یکنواخت شود. در غیر این صورت هنگام برقرار کردن جریان وشروع به کار دستگاه، DNA از مسیر اصلی خود منحرف خواهد شد.پس از 20 دقیقه که ژل بسته شد،شانه ها را به آرامی وبه گونه ای که ژل نشکند، از ژل جدا می کنیم. و روی ژل بافر TAE 1Xبه مقدار لازم که سطح ژل را بپوشاند می ریزیم در محل دندانه های شانه، چاهک هایی در ژل ایجاد می شود که می توان DNA را درون این چاهک ها بارگذاری کرد. پس از بارگذاری تمام نمونه ها،تانک ژل را به منبع برق وصل کرده وجریان 50 ولت به مدت 45 دقیقه را برقرار می کنیم .پس از اتمام الکتروفورز به منظور مشاهده باندها،ژل را به آرامی از سینی الکتروفورز جدا کرده ودر نهایت ژل را در دستگاه ژل داکیومنت (شکل 3-14) قرار داده و با استفاده از نور ماورای بنفش،باندهای DNA مشاهده می شود.

شکل 3-14- دستگاه ژل داکیو منتیشن برای عکس برداری از ژل
وجود یک باند ضخیم و روشن در قسمت بالای ژل بدون کشیدگی،نشان دهندهDNA با کیفیت عالی می باشد(شکل 3-15 )وجود کشیدگی در فاصله بین چاهک وباند نشانه وجود آلودگی پروتئینی یا سایر آلودگی ها است. وجود یک باند اضافی در پایین ژل و در فاصله ای زیاد از باند اصلی ،نشانه وجود RNA در نمونه ها می باشد.

شکل 3-15- پروفیل باندی 22 نمونه انتخاب شده DNA
3-4-2-1- آماده کردن نمونه ها جهت تعیین کیفیت DNA
در این مرحله میزان 5/2 میکرولیتر DNA خالص مرزه هر نمونه را با2 میکرو لیتر ماده آبی رنگی 6x DNA Loading dye مخلوط کرده و به آرامی بداخل چاهک های ژل آگارز تزریق می کنیم.
3-5- افزایش کیفیت DNA
پس از انجام اسپکتروفتومتری چنانچه نسبت OD 260/ OD280 بیش از2 ویا کمتر از 3/1 باشد ویا در صورت تشکیل اسمیر برای افزایش کیفیت DNA نمونه ها رابطور مجدد شستشو می دهیم.
3-5-1- پروتکل شستشوی مجددDNA
1- افزودن 2 حجم اتانول خالص سرد(400 میکرولیتر) وقرار دادن بمدت 40 دقیقه در 20- درجه سانتی گراد.
2- سانتریفوژ rpm 6000 بمدت 3 دقیقه.
3- مایع رویی دور ریخته شود.
4- Pellet را با اتانول 70% سرد می شوییم.
5- سانتریفوژ در rpm7000 در 3 دقیقه.
6- مایع رویی دور ریخته شود.
7- Pellet را خشک می کنیم(وکیوم 3 دقیقه).
8- مجددا در 150 میکرولیتر(0.1 : 10)TE حل شود.
3-5-2- پروتکل شستشوی DNA هنگام تولید اسمیر
1- افزودن 2 میکرولیتر RNase ونگهداری در 37 درجه سانتی گراد (1 ساعت).
2- افزودن یک حجم ایزوآمیل-کلروفرم ورتکس کوتاه وسانتریفوژ در rpm 14000 بمدت 15 دقیقه.
3- مایع رویی برداشته شود.
4- افزودن 10/1 حجم سدیم استات و2 حجم اتانول خالص،نگهداری در 80- درجه سانتی گراد (یک ساعت).
5- سانتریفوژ در rpm 14000 بمدت 10 دقیقه.
6- مایع رویی دور ریخته شود شستشو با اتانول 70% ،سپس سانتریفوژ در rpm 14000 بمدت 3 دقیقه.
7- مایع رویی را دور ریخته شود.
8- Pellet خشک شود(وکیوم 10 دقیقه).
9- افزودن 200 میکرولیتر(1/0: 10)TE و نگهداری در 20- درجه سانتی گراد.
3-6- مراحل اجرای تکنیک ISSR
3-6-1- رقیق کردن نمونه ها
برای تهیه نمونه های مناسب PCR ابتدا نمونه ها را با آب دیونیزه تا حد 5 نانوگرم رقیق می کنیم بدین صورت که مقداری از DNA نمونه را با H2O dd در تیوب های جدید مخلوط می کنیم.
3-6-2 – تکثیر ISSR
3-6-2-1- استفاده از پرایمر ها
با مطالعه وبررسی پژوهش های انجام شده با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR برای سه گونه مرزه مورد مطالعه ، 10 پرایمر تصادفی انتخاب شدند (جدول3-3). این آغازگرها به صورت خشک تهیه شده بود که با آب دو بار تقطیر استریل ،رقیق شده ودر فریزر نگهداری می شوند.
ساخت آغازگرها توسط شرکت آلمانی انجام شد.از میان آغازگرها سه آغازگر با تولید نوارهای چند شکلی مورد استفاده قرار گرفتند.بقیه آغازگرها نوار چند شکل تولید نکردند یا ضعیف ونامشخص بود مشخصات آغازگرها درجدول زیر آمده است .
جدول 3-3 – فهرست آغازگرهای مورد استفاده و توالی آنها
ردیف
نام آغازگر
توالی
1
UBC808
AG AG AG AG AG AG AG AG C
2
UBC 820
GT GT GT GT GT GT GT GT C
3
UBC 844
CT CT CT CT CT CT CT CT RC
4
UBC 801
AT AT AT AT AT AT AT AT T
5
UBC 802
AT AT AT AT AT AT AT AT G
6
UBC 803
AT AT AT AT AT AT AT AT C
7
UBC 804
TA TA TA TA TA TA TA TA A
8
UBC 805
TA TA TA TA TA TA TA TA C
9
UBC 806
TA TA TA TA TA TA TA TA G
10
UBC 807
AG AG AG AG AG AG AG AGY T

مطلب مشابه :  مشاهده

Y= C /T R = A /G

3-6-2-2 – واکنش زنجیره ای پلیمرازPCR33
واکنش زنجیره ای پلیمراز یک روش آزمایشگاهی است که به منظور تولید انبوه قطع? خاصی ازDNA باطول و توالی مشخص به کار می رود. این روش که مبتنی بر تکثیر آنزیمی قطعه ای ازDNA است که استفاده از دو آغازگر34 چند نوکلئوتیدی35 صورت می گیرد . این الیگو نوکلئوتیدها به عنوان آغازگر به کار می روند تا کپی شدن الگویDNA توسط آنزیم پلیمراز امکان پذیر می شود. در این فرآیند که تقلیدی از فرآیند همانند سازیDNA در طبیعت است الیگو نوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شد? دو انتهای قطع? مورد نظرDNA هستند به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می گیرند تا واکنش آنزیمی همانند سازی DNA در درون لول? آزمایش امکان پذیر شود . این همانند سازی فرآیند آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم های پلیمراز صورت می گیرد. الیگو نوکلئوتیدها یا آغازگرها پس از اتصال به رشت? الگو برای توسع? رشته های DNA جدید در دو جهت مخالف عمل می کنند . با انتخاب صحیح جایگاه های اتصال آغازگر و شرایط مناسب واکنش، رشت? جدید DNA ساخته خواهد شد شرایط مناسب شامل غلظت نمک ، درجه حرارت و pH مناسب می باشد. بطور کلی واکنش زنجیره ای پلیمراز دارای سه مرحله است .
مرحل? اول یا مرحل? واسرشته سازی 36
DNA الگو در دمای زیاد ( 94-92 درجه سانتی گراد ) واسرشته شده و رشته های مکمل از همدیگر جدا می شوند .
مرحل? دوم یا مرحل? اتصال آغازگر37در دمای کمتر ( 65-35 درج? سانتی گراد ) نسبت به مرحل? اول صورت می گیرد. شرایط اتصال آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی به ناحیه مکمل بر روی DNA الگو فراهم می شود .
مرحل? سوم یا مرحل? توسع? آغازگر38 که معمولاً در دمای 72 درجه سانتی گراد صورت می گیرد . ساخته شدن DNA جدید از طریق افزوده شدن نوکلئوتیدها به انتهای آغازگر بر مبنای الگوگیری از رشت?DNA موجود و پلیمریزه شدن نوکلئوتیدها امکان پذیر می شود. آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی در حضور 4 دی اکسی نوکلئوتید (dTTP, dCTP , dATP , dGTP ) و شرایط بافری خاص توسعه می یابند و در نتیجه ناحیه DNA الگو بین دو آغازگر تکثیر می شود . بدین ترتیب در نخستین دور PCR دو رشت? جدید ایجاد می شود و تعداد کپی های ناحی? هدف دو برابر می شود ، یعنی پس از اولین دور PCR رشته های اولیه، دو رشت? جدید کوتاهتر از رشته
های اولیه را خواهیم داشت . معمولاً چرخه های PCR 25 تا 40 بار تکرار می شوند . واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از پلیمراز DNA تک39 که از نوعی باکتری گرما دوست بنام ترموس آکواتیکوس گرفته شده است مزایای فراوانی دارد . این آنزیم در برابر دما دارای ثبات می باشد . بنابراین پس از هر چرخه ای که در آن رشته

برای دانلود متن کامل فایل این  پایان نامه می توانید  اینجا کلیک کنید

دیدگاهتان را بنویسید