مقاله – شناسایی و بررسی حضور باکتری های بی هوازی نفت زی قادر به استفاده از …

  • دستگاه pH متر
  • یخچال
  • حمام بخار
  • چراغ مطالعه
  • ویال های بی هوازی
  • ۳-۴ مواد مورد استفاده
    محیط کشت نوترینت براث ( N.B ) ، MSM ، BSM ، نیترات براث ، BHI و BHIA ، محلول ویتامین ها و Trace mineral
    اولین محیط کشت مورد استفاده محیط کشت BSM می باشد که به صورت کاملا بی هوازی آماده کردیم و به آن نفت تلقیح کردیم تا پس از یک هفته رشد باکتری های بی هوازی را در آن مشاهده کنیم. Trace element که یکی از ترکیبات محیط کشت اصلی ما می باشد و خود شامل ترکیباتی است که در قسمت پیوست ۱ ذکر شده اند ، به صورت محلول تهیه شد و در تمام مراحل کشت باکتری های بی هوازی به میزان ml 1 از این محلول اضافه شد. محلول ویتامین ها نیز در شرایط کاملا استریل و زیر هود UV به صورت تازه تهیه شد و از فیلتر استریل عبور داده شد سپس در مراحل کشت باکتری ها به میزان ۰٫۱٪ به محیط کشت اضافه شد. زیرا باکتری های بی هوازی احیا کننده نیترات پر نیاز هستند و ما با اضافه کردن محلول Trace و ویتامین ها محیط رشد این باکتری ها را کمی غنی تر می کنیم.
    در مرحله بعد از محیط کشت نوترینت براث استفاده میکنیم و پس از تزریق نفت به محیط به مدت ۵ الی ۷ روز در دمای ۴۰ درجه سانتی گراد قرار می دهیم و پس از مشاهده رشد باکتری ها می توانیم از این محیط به محیط کشت BSM که قبلا تهیه کرده بودیم تلقیح نموده و نتیجه را مشاهده نماییم. از هفته ی ششم به بعد ما محیط کشت MSM که یک محیط حداقل نمکی میباشد و برای رشد باکتری های بی هوازی مناسب است تهیه کردیم و به آن ترکیب KNO3 نیز اضافه کردیم تا محیط کشت کمی اختصاصی تر عمل کند زیرا KNO3 خود در یک مرحله باعث جدا شدن احیا کننده های نیترات از سایر باکتری های بی هوازی رشد کرده خواهد شد. استفاده از محیط های کشت اختصاصی تر مثل نیترات براث و محیط کشت غنی شده BHI رشد و جداسازی باکتری های بی هوازی NRB را تسهیل کرد. با استفاده از محیط کشت اختصاصی نیترات براث و تغییر رنگ محیط کشت ما از وجود باکتری های احیا کننده نیترات در محیط مطمئن شدیم و برای جلوگیری از رشد احیا کننده های سولفات ( SRB ) در محیط مقدار KNO3 اضافه شده را افزایش دادیم و همچنین از محیط کشت بسیار غنی BHI استفاده نمودیم. در همه مراحل کشت به میزان ۰٫۱٪ گلوکز هم به محیط اضافه کردیم.
    ۳-۵ روش کار
    اولین مرحله در این تحقیق پس از مطالعه ی منابع مربوطه و داشتن اطلاعات کافی ، نمونه برداری می باشد که بر حسب موضوع تحقیق می توان از حوضچه ها ، چاه های نفت و یا مخازن پالایشگاه ها استفاده کرد. نحوه ی نمونه برداری به وسیله ی استفاده از ظروف شیشه ای با درپوش مناسب استریل میباشد. نمونه ها درون ظروف شیشه ای درپوش دار استریل معمولا توسط هلی کوپتر به آزمایشگاه منتقل می شوند و تا زمان ایزوله کردن باکتری ها، در یخچال ۴- درجه نگهداری می شوند.
    زمان نمونه گیری دما و بافت نمونه ها بررسی شده است. نمونه ها از سکوهای نفتی سلمان ، سروش ، بلال ، Rو R4 در منطقه لاوان در استان خوزستان گرفته شده اند و شرایط هر نمونه به صورت زیر گزارش شده است:

    • نفت سکوی سلمان : دما ۴۰-۲۴ درجه ، بافت نمونه سبک و رقیق
    • نفت سکوی سروش : ۶۵ درجه ، بافت نمونه بسیار سنگین و غلیظ
    • نفت سکوی بلال : دما ۶۰ درجه ، بافت نمونه سبک
    • نفت سکوهای R1 و R4 : دما به ترتیب ۵۵ درجه و ۵۶٫۲ درجه ، بافت نمونه بسیار سبک

    شکل ( ۳-۱ ) سکوی نفتی سلمان واقع در منطقه لاوان
     
    نفت خام مورد استفاده در این تحقیق از نوع نفت خام بومی ایران می باشد. پس از نمونه گیری یک مرحله غنی سازی باکتری هایی که از نفت خام به عنوان تنها منبع کربن و انرژی استفاده می کنند صورت می گیرد. سپس بعد از مدت زمان مقرر باکتری ها جداسازی می شوند. در حالت غربالگری سویه ها از نظر توانایی رشد روی نفت خام که تنها از ازت به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده میکند مورد آنالیز قرار می گیرند.
    شکل ( ۳-۲ ) سکوهای نفتی جزیره لاوان در استان خوزستان
     
    ۳-۵-۱ مرحله اول
    در ابتدای کار قبل از تهیه ی محیط کشت وسایل مورد نیاز را کاملا تمیز و در طی ۴ مرحله ( آب و شوینده-آب مقطر-الکل و استون ) میشوریم. سپس محلول Trace element را تهیه میکنیم که یکی از ترکیبات محیط کشت اصلی ما ( BSM ) می باشد. پس از ترکیب شدن کامل مواد pH محلول را به ۷ میرسانیم. (با استفاده از KoH ) از این محلول Trace element تهیه شده به میزان ml 1 به محیط کشت اصلی اضافه می شود. در مرحله ی بعدی محلول ویتامین ها را آماده میکنیم . باید توجه شود که محلول ویتامین ها باید تازه تهیه و مصرف شوند. ( زیر هود و در شرایط استریل )
    پس از وزن کردن دقیق ترکیبات گفته شده به میزان معین توسط ترازوی دیجیتال میزان ml 1000 آب مقطر به آنها اضافه کرده سپس محلول به دست امده را توسط سرنگ زیر هود از فیلتر استریل عبور میدهیم که در نهایت یک محلول شفاف و بی رنگ از ویتامین ها به صورت تازه خواهیم داشت. (محلول ویتامین نیاز به اتوکلاو کردن ندارد). مرحله آخر تهیه ی محیط کشت اصلی می باشد .
    همگی این ترکیبات در ml 1000 آب مقطر حل شده سپس ml 1 از محلول Trace element و ml 1 از محلول ویتامین ها و در آخر به میزان ml 1 رزازورین ( نشانگر ) به محیط کشت اضافه میکنیم.
    pH محیط کشت BSM را به ۷٫۲ می رسانیم. محلول محیط کشت را در شیشه یا ویال های کوچک بی هوازی وارد میکنیم و پس از بستن و محکم کردن درپوش آلومینیومی سر ویال ها با سرنگ هوای موجود در شیشه ها را کاملا خارج میکنیم. ( می توان محلول را روی هیتر یا شعله ی مستقیم حرارت داد تا بجوشد و اکسیژن محلول در آن خارج شود ). سپس به محلول گاز ازت ( N2 ) وارد میکنیم و پس از اطمینان از عدم حضور اکسیژن ویال ها را در اتوکلاو قرار داده ( دمای ۱۲۰ درجه ) تا استریل شوند. اکنون محیط کشت ما برای تلقیح باکتری های نفتی که از مخازن نفتی منطقه ی لاوان بدست می آیند آماده است.
    ۳-۵-۲ مرحله دوم
    روش تلقیح و کشت باکتری
    برای کشت باکتری ها هم میتوان زیر هود شیمیایی کار کرد هم میتوان با استریل کردن سکوی کار ( شعله پاشی ) و روشن کردن دو شعله بین دو شعله کار کرد. به تعداد ۲۰ ویال از محیط کشت BSM داریم که در ابتدا برای کشت از نفت سکوی سروش استفاده کردیم و با سرنگ ۲ یا ۲٫۵ به میزان کمتر از ml 1 نفت خام به محیط کشت تزریق میکنیم. ( بدون وارد شدن هوا )
    به همین ترتیب از حدودا ۹ نفت خام از سکوهای مختلف نوروز-سلمان-سروش و … استفاده کردیم و به محیط کشت تزریق کردیم. سپس نمونه ها را بر طبق مقالات مطالعه شده در دمای ۴۰ درجه و به مدت ۵ روز در انکوباتور معمولی قرار میدهیم . پس از مدت طی شده نمونه ها بررسی شدند و مشاهده شد باکتری ها کاملا رشد کرده اندو در محلول کاملا حالت امولسیون را ایجاد مینمایند. که در اینصورت میتوان از آنها لام تهیه کرد و باکتری را مشاهده کرد. پس از این مرحله باید بتوانیم باکتری خود را شناسایی کنیم زیرا در محیط کشت ما همه ی باکتری های بی هوازی در حال رشد می باشند و ما باید باکتری بی هوازی نفت خوار خود را شناسایی کنیم. در هفته ی سوم از مراحل پژوهش ما تعدادی محیط کشت BSM دیگر ساخته (مطابق روشهای قبل) و در نهایت کشت نفت را انجام دادیم. در مرحله ی بعد به تعداد ۴ ویال ml 50 را آماده کرده و کاملا میشوریم سپس محیط کشت نوترینت براث آماده میکنیم.(در حجم ml 250 ) . روی میزان معینی که وزن کردیم ( ۱۳ گرم) میزان ۲۵۰ میلی لیتر اب مقطر اضافه میکنیم سپس ارلن را روی حرارت قرار میدهیم و با همزن آن را کاملا یکدست و شفاف میکنیم و محلول را در ویال های ml 50 آماده شده ریخته و درپوش آلومینیومی آن را با کریمپر کاملا میبندیم و با سرنگ هوای داخل آن را خارج میکنیم سپس گاز ازت را توسط روش ۲ سرنگ داخل محیط نوترینت براث پرچ میکنیم تا هوا و اکسیژن محلول در مایع کاملا خارج شود. (ابتدا سرنگ را کامل در محلول فرو برده و گاز N2 میزنیم و بعد از آن در قسمت بالایی ویال که خالی از محلول می باشد هم همین کار را تکرار میکنیم پس از اتمام کار ابتدا سرنگ هوادهی را خارج میکنیم و چند ثانیه بعد هم سرنگ متصل به کپسول گاز را خارج میکنیم تا کاملا اکسیژن موجود در محیط کشت خارج شود و شرایط بی هوازی ایجاد شود).
    سپس ویال های آماده شده را بمدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه اتوکلاو کرده تا استریل شوند و اماده ی کشت و تلقیح نفت خام باشند. بعد از کشت نفت ( ml 0.1 ) به محیط نوترینت براث و قرار دادن در انکوباتور به مدت ۳ الی ۵ روز در دمای ۴۰ درجه و رشد کامل باکتری ها میتوانیم از این محلول به محیط کشت BSM که قبلا تهیه کرده بودیم تزریق کنیم تا رشد باکتری های آن را مشاهده کنیم. این کار در اصل غنی سازی باکتری های نفتی ما میباشد. (کشت ۱% (محیط کشت نوترینت براث که در انکوباتور قرار داده شد و باکتری ها در آن رشد کردند اکنون برای تهیه ی لام آماده است. ۶ ویال ml 50 دیگر محیط کشت BSM آماده کرده و پس از وارد کردن گاز نیتروژن به انها مقداری نفت استریل یا کوئینولین به عنوان منبع کربن به آنها اضافه می گردد.( به میزان ml0.1 یا یک خط از سرنگ انسولین ). اگر از نفت به عنوان منبع کربن استفاده کردیم باید پس از تزریق به محیط کشت آن را در اتوکلاو ۱۲۲ درجه استریل کنیم. پس از انجام این مراحل از محیط کشت NB که قبلا در آن کشت داده بودیم به داخل این محیط BSM که دارای نفت استریل به عنوان منبع کربن می باشد در شرایط استریل (زیر هود) تزریق میکنیم و در انکوباتور ۴۰ درجه به مدت ۵ روز قرار میدهیم تا در شرایط بی هوازی باکتری ها در آن رشد کنند.
    ۳-۵-۳ مرحله سوم
    روش رنگ آمیزی منفی
    ۱ قطره از نمونه را گوشه ی لام ریخته و ۱ قطره رنگ مرکب چین روی آن می ریزیم و پس از ۵ دقیقه یک لام دیگر را به صورت شیب دار روی لام اصلی تا انتهای آن می کشیم و اصطلاحا گسترش تهیه می کنیم و پس از خشک شدن زیر میکروسکوپ مشاهده می کنیم . علت استفاده از این روش رنگ آمیزی مشاهده ی آرکی باکتر ها در صورت وجود می باشد.
    ۳-۵-۴ مرحله چهارم
    روش رنگ آمیزی گرم
    ۱ قطره کریستال ویوله – به مدت ۱ دقیقه – شستشو با آب مقطر
    ۱ قطره لوگل – به مدت ۱ دقیقه – شستشو با آب مقطر

    دانلود متن کامل این پایان نامه در سایت abisho.ir