اندازه گیری

اندازه گیری

در مرحله بعد فاز بالایی را به آرامی با سمپلر استریل جدا کردهدر میکروتیوب جدید ریخته و 700 ماکرولیتر ایزوپروپانول (از قبل در فریز بوده است) اضافه کرده به آرامی میکرو تیوب ها را سر و ته کرده و مجددا در 12000 دور دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ کرده رسوب سفید رنگ ته نشین شده توده DNA می باشد.ایزوپروپانول را به آرامی ریخته، در هوای اتاق 3 تا 4 دقیقه قرار داده سپس مقدار 500 ماکرولیتر الکل 70 درصد با 8000دور، دمای 4 درجه سانتی گرادبه مدت 5 دقیقه سانتریفیوژکردهفاز رویی را خالی کرده و برای تبخیر الکل به مدت 30 دقیقه میکروتیوب را در مکان تمیز در آزمایشگاه قرار داده سپس 50 تا 100 میکرولیتر آب مقطر استریل درون میکروتیوب ریخته و در یخچال نگهداری شد (Kennedy et al.,2008).
3-5-2 بررسی کیفیتDNA
جهت اطمینان از بدست آمدنDNA مطلوب محلول نهایی فوق از ژل آگاروزراناستفاده کردهبه این صورت که 3/0 گرم آگاروز را با 30 میلی لیتر محلول TE حل کرده،بعد از ژله ای شدن، DNA را با سمپلر استریل درون چاهک ها تزریق کرده سپسبا استفاده از دستگاه الکتروفوروز افقی با ولتاژ 75 به مدت 40 دقیقه این عمل انجام گرفت.
3-5-3 PCR
مواد PCR عبارت اند ازµ5/0dNTPs ، بافرµ5/2(Tris،KCL ،pH 8/4 )، µ1MgC، پرایمرهاµ1،Taq DNA پلیمراز µ3/0و رشته های الگو CMT- µ1. دمای موثر در فرآیندPCR 50 درجه سانتی گراد بوده است (Kennedy et al.,2008). بعد از بارگذاریمحصول PCR بر ژل آگاروز مقدار باندهای بدست آمده را با استفاده از مارکر DNA Ladder1Kb –RTUمقایسه گردید)تصویر 3-13 ).
3-6سنجش میکروبی
3-6-1آزمون حساسیت آنتی بیوتیک کربی بایر
آزمون کربی بایر سنجش حساسیت باکتری نسبت به رقت های مختلف آنتی بیوتیک استبه این صورت که دیسک های آغشته به آنتی بیوتیک را بر محیط کشت باکتری قرار می دهند در اطراف دیسک باکتری رشد نمی کند قطراطراف دیسک را منطقه ی مهاری رشد می نامند. اندازه قطر این منطقه بستگی به میزان اثر آنتی بیوتیک بر رشد آن باکتری دارد.هرچه آنتی بیوتیک اثر قویتری داشته باشد منطقه مهاری بزرگتری ایجاد می گردد.غلظت آنتی بیوتیک با دور شدن از دیسک کمتر می شود در نتیجه مقدار کلنی ها نزدیک تر کمتر یا بدون هیچ کلنی می باشد از این برآورد برای میزان انتشار اثر آنتی بیوتیک استفاده می شود(Johnson et al.,2012).
مواد ضدباکتری به دو دسته موادباکتریواستاتیکی یا مهارگر باکتری و باکتریوسیدالی یا مواد کشندهباکتری تقسیم می شوند.باکتریواستاتیک به هر ماده ای که می تواند رشد باکتریها را متوقف واز تقسیم باکتری جلوگیری کند، باکتریوسیدال به موادی که قابلیت نابود سازی مستقیم باکتری را داشته باشد می گویند.
3-6-2 بررسی اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج . Callyslpongia sp خشک شده
جهت سنجش اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج، ابتدا محیط کشت مولر هینتون آگار تهیه شد سپس هریک از میکروب ها به روش خطی کشت داده شدند و مقدار 20 میکرولیتر از عصاره Dبر دیسک دیفیوژن بلانک 6 میلی متری ریخته با پنس استریل به آرامی روی محیط کشت درنقاط مختلف قرار داده، برای کنترل منفی از حلال هایی که عصاره از آن تهیه شده بود استفاده گردید و برای کنترل مثبت دیسک آنتی بیوگرام نیتروفلوستاتین و جنتامایسین به کار رفت.قطر هاله عدم رشد باکتریبا استفاده از خطکش میلی متری اندازه گیری شد (et al.,2011. Darah).
3-7-3بررسی اثر ضد میکروبی عصارهالکلی اسفنج Callyslpongia sp.
کشت میکروب و کنترل منفی و مثبت مانند بندفوق) 3-6-2) انجام شد و قطر هاله ایجاد شده با استفاده از خط کش میلی متریاندازه گیری شد.
3-6-4بررسی اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج منجمد شده Callyslpongia sp.
کشت میکروب و کنترل منفی و مثبت مانند فوق) 3-6-2) انجام شد و قطر هاله ایجاد شدهبا استفاده از خط کش میلی متریاندازه گیری شد.
3-6-5(MinimumInihibitory Concentration)MICو )MBC(Minimum BacteriaConcentration
MIC(MinimumInihibitory Concentration)حداقل غلظت مهاری یا غلظتی از آنتی بیوتیک است که می تواند رشد باکتری را در شرایط آزمایشگاهی مهار کند(Subramani et al.,2013). در این تحقیق سه رقت از عصاره تهیه شد و هریک در محیط کشت مایع نوترینت براث بر میکروب ها تلقیح شد، بعد از 24 ساعت انکوباسیون کدورت محیطکشت ها با دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه گیری شد.
MBC(Minimum BacteriaConcentration) حداقل غلظت باکتری یا حداقل تعداد کلنی باکتری می باشد.اگرهریک ازMIC بر محیط کشت مولر هینتون آگارکشت داده شود تعداد کلنی ایجاد شده را شمارش کرده مقدار MBC به دست خواهد آمد. نسبتMIC به MBC شاخص باکتریواستاتیک به باکتریوسیدال می باشد(Johnson et al.,2012).
3-7کدورت سنجی محیط کشت میکروبی مایع
3-7-1تهیه سوسپانسیون میکروبی 5/0 مک فارلند
مقدار 175/1 گرم کلرید باریم را در 100 سی سی آب مقطر حل کرده در ارلن دیگر اسید سولفوریک 1% تهیه کرده سپس 5/0 سی سی محلول کلرید باریم را به 5/99 سی سی اسید سولفوریک 1%اضافهکرده حجم نهایی را به 100 سی سی رسانده، محلول بدست آمده کدر همان کدورت 5/0 مک فارلند معادل کدورت ×1 باکتری می باشد(Darah et al.,2011).
درتصویر 3-18 لوله آزمایش سمت راست حاوی سوسپانسیون میکروبی، لوله سمت چپ محلول 5/0 مک فارلند ولوله وسط آب مقطر به عنوان شاهد می باشد.
تصویر 3-11 مقایسه محلول های میکروبی 5/0 مک فارلند و کلرید باریم
3-8-1رقت مهار کننده های رشد میکروبی
در زیست شناسی و پزشکی رقت به منظور کاهشغلظت موجودات زنده ی میکروسکوپی یا تعداد سلول های نمونه مورد استفاده قرار می گیرد .به عنوان مثال تعداد و اندازه ی کلنی باکتری ها در پلیت آگار در یک زمان معین رشد وابسته به غلظت آنهاست بیان مقدار حداقل غلظتی که می تواند اثر مهار کنندگی رشد میکروبی را داشته باشداست (http://en.wikipe dia.org/wiki/serial_dilution).

Share